应用光交联反应鉴别活性小分子与蛋白质的结合位点

药物与医疗

作者：X-MOL

2016-12-22

光交联反应（也称作光亲和标记，photoaffinity labeling, PAL）指小分子配体在光照作用下与生物大分子生成共价键的化学反应。这类反应被广泛用于药物化学、化学生物学、生物化学等领域。咱们今天以哥德堡大学Kristina Luthman等人在J. Med. Chem.近期发表的一篇文章为例，给大家介绍一下光交联反应在鉴别小分子与蛋白质结合位点中的应用。

故事的起源很简单，该课题组前期研究发现Chroman-4-one是Sirtuin-2 (SIRT2)选择性抑制剂。这篇文章要解决的问题就是Chroman-4-one到底结合到SIRT2的什么位置。有的同学说了，这还不好办？做个Chroman-4-one与SIRT2的共晶不就一目了然啦。这个想法固然很好，但是要知道普天之下纯蛋白常有，而晶体结构不常有。

抛开共晶技术，原文作者利用光交联反应和生物质谱技术解决了鉴定结合位点的问题。作者先是在Chroman-4-one上引入了常见的光亲和基团得到了探针4和探针5。活性评价后发现探针4的活性优于探针5，因此选择探针4进行了后续研究。

图片来源：J. Med. Chem.

既然是光亲和基团，那么应该首先研究探针4的光交联反应性质。其光交联反应的基本原理就是探针4里面的diazirine基团在365 nm紫外光照射下产生卡宾，卡宾插入醇羟基或氨基。作者通过探针4的UV光谱，1H NMR和19F NMR对其光交联反应性质进行了研究。

图片来源：J. Med. Chem.

后面的研究就很清晰明了，用探针4对重组的SIRT2进行光亲和标记。将两者共孵育，并给予UV-365 nm照射，被标记的SIRT2经酶切后得到肽段混合物，利用LC-MS/MS进行蛋白质组分析。结果表明，异亮氨酸175（Ilu175）至赖氨酸210（Lys210）的肽段被探针4标记到了。

图片来源：J. Med. Chem.

作者又对该肽段进行了MS/MS/MS的分析，希望进一步确定到底哪个氨基酸残基被标记。很遗憾的是，经过多番努力也没有得到确切结果，作者对此也在文中也分析了一些可能的原因。

既然实验层面找不到精确的结合位点，那么只能进行理论计算啦。由于明确了探针标记的肽段，这就可以在SIRT2的晶体结构中准确找到结合区域。分子模拟的结果显示，探针4的diazirine基团与组氨酸187（His187）的空间距离较近，非常有可能发生光交联反应。至此，作者用探针4对SIRT2进行了光亲和标记，通过生物质谱手段明确了探针4的结合区域，结合分子模拟结果得到了探针4与SIRT2之间可能性很高的结合模式。

图片来源：J. Med. Chem.

这篇文章在J. Med. Chem.杂志中算不上什么鸿篇巨制，但是可称得上是小巧玲珑。探针设计中选用了两个体积非常小的光亲和基团，以最大程度上维持生物活性。探针光交联反应性质的研究逻辑严密，丝丝入扣。质谱解析部分虽然没有最终得到精确的标记氨基酸，但是标记肽段的确定和分子模拟的综合应用也是合情合理的。一句话，这文章确实值得搞药靶研究的同学们好好学习。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jmedchem.6b01117

Identification of the Binding Site of Chroman-4-one-Based Sirtuin 2‑Selective Inhibitors using Photoaffinity Labeling in Combination with Tandem Mass Spectrometry

J. Med. Chem., 2016, 59, 10794-10799, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.6b01117

（本文由乐只君子供稿）

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